流式細胞術是一項非常實用的技術，其特點是方便快捷，結果準確，且能成功的對目標細胞進行分選，但是提起流式抗體具體要怎么選，估計很多小伙伴都會犯難，實驗前需要考慮的是流式抗體的選擇和熒光素的搭配，那么接下來就給大家分享一下在選擇流式抗體時有哪些注意事項吧。
 

　　選流式抗體需注意哪些問題?
 

　　1、抗體的基本要求
 

　　a. 清楚知道待測靶標是胞內還是胞外蛋白;
 

　　b. 嚴格按照樣品來源選擇抗體反應性;
 

　　c. 必須選擇明確標注可用于流式實驗的抗體，不能用普通抗體代替。
 

　　2、流式細胞儀的要求
 

　　a.了解所用的流式細胞儀有幾個激光器，常見的激光器有405nm、488nm和633nm等，目前大部分的流式細胞儀都配有488nm和633nm2個激光器;
 

　　b. 知道每個激光器下有幾個檢測通道，通道數(shù)決定一次多測多少個指標;
 

　　3、熒光標記的選擇
 

　　a. 有直標抗體的話，盡量選直標，間接標記二抗增加實驗步驟，多次清洗造成會細胞損失，染色準確性也低;
 

　　b. 弱表達靶標，盡量選擇強熒光素標記抗體，PE>APC>FITC>PerCP。
 

　　4、多色搭配方案
 

　　a. 每個通道只能用一種標記，如FITC和AF488，兩種標記的激發(fā)波長和發(fā)射波長均相近，所以不能同時用這兩種標記;
 

　　b. 盡量減少光譜重疊，如PE-cy5和APC，兩者同用時調補償值過大;
 

　　c. 弱靶標配強熒光素，如Treg細胞中CD4表達量高于FoxP3，所以FoxP3應使用強熒光素標記抗體;
 

　　d. 五色及以上配色建議查閱文獻，或者咨詢抗體廠商。
 

　　5、如何調補償?
 

　　多色流式實驗，由于各個熒光素存在光譜的重疊，因此需要進行補償調節(jié)，在550nm附近，兩種染料存在光譜重疊。
 

　　下圖為CD3-FITC，CD4-PE的染色補償調節(jié)過程，調補償簡單的一個詞就是：“橫平豎直”，慢慢理解哦!
 

　　6、同型對照?
 

　　同型對照的目的是為了減少背景干擾，更好展現(xiàn)抗原與抗體的結合強度，尤其對于一些胞內蛋白、低表達或連續(xù)表達蛋白，同型對照的設置顯得尤為必要。同型對照需要選擇與染色的單克隆抗體相同種屬來源，相同抗體亞型，相同熒光標記的抗體。